為什么提取植物RNA這么難？如何解決？

植物RNA提取中常見的問題是提取產(chǎn)物的總量少，RNA質(zhì)量差。植物的細胞中有很多代謝物，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖和次生代謝物等。進行RNA提取時，必須裂解細胞破壞植物膜釋放RNA，在裂解步驟中RNA不可避免會與這些代謝物混合。這些代謝物在結(jié)構(gòu)上與核酸相似，會發(fā)生共沉淀反應(yīng)，從而降低了RNA提取的產(chǎn)量和質(zhì)量。抽提足夠的高質(zhì)量植物RNA的難點就在于將RNA與這些代謝物進行分離。

除了代謝物豐富以外，還有一些特性也會增加植物RNA的提取難度：

1、氧化多酚類次級代謝物（如醌）可以與核酸發(fā)生不可逆的結(jié)合反應(yīng)，并成為后續(xù)反應(yīng)的抑制劑或降解RNA；

2、許多植物樣品存在一些固有特征，比如含有高水平RNases（會降解RNA）、由于高含水量導(dǎo)致RNA濃度很低，纖維組織（如木質(zhì)素）難以分解和移除等。

目前已經(jīng)發(fā)布了數(shù)以千計的植物RNA提取方案。但大多數(shù)都基于以下三種方法：

苯酚法：主要用于具有高濃度次生代謝物的植物。苯酚通常與氯仿結(jié)合以去除多糖污染物。

Trizol法：Trizol已被用于從特定組織（如擬南芥種子）中提取RNA。Trizol是一種市售試劑，可將苯酚和異硫氰酸胍結(jié)合在單一溶液中，以便在快速分離過程中產(chǎn)生高產(chǎn)量的RNA。在這種方法中，trizol與氯仿、異丙醇和乙醇在無RNase的水中混合以去除污染物。

CTAB法：十六烷基三甲基溴化銨或基于CTAB的方法已用于提取具有高多糖、二級產(chǎn)物或高水平RNase的植物樣品。CTAB提取緩沖液基本上由2%十六烷基三甲基溴化銨、1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、100mM Tris-HCl、1.4M NaCl和20mM EDTA組成。這種方法首先去除多糖，然后是蛋白質(zhì)，最后是次級代謝物。該方法還可以添加濃度約為0.5%的十二烷基硫酸鈉（SDS）。SDS是一種去污劑，可與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，有助于在提取過程中去除蛋白質(zhì)污染物。

大多數(shù)RNA提取可分為四個步驟：

1、均質(zhì)化：組織可新鮮或冷凍獲取。當(dāng)沒有合適的實驗室條件時（如從野外工作中收獲），樣品會在室溫下保存在高鹽溶液中，直到在實驗室處理。使用新鮮或冷凍組織時，樣本準(zhǔn)備好后，通常將其放置在研缽中用研杵研磨成細粉（也可以使用帶有珠子的均質(zhì)器）。

2、裂解：組織變成粉末后，加入裂解液。在這種情況下，可以使用苯酚、Trizol或CTAB裂解細胞以釋放RNA，這一步驟很容易產(chǎn)生雜質(zhì)污染。這是因為當(dāng)細胞膜破裂時，所有細胞內(nèi)容物會同時釋放，這意味著RNA與所有其他細胞成分結(jié)合，多糖和多酚等代謝物可以與RNA更緊密地接觸。同時，RNA酶也開始發(fā)揮作用，增加了RNA降解的風(fēng)險。有些提取試劑的作用類似于RNA酶抑制劑，可以減少RNA完整度受損的可能。

3、清洗：使用不同的互補試劑去除雜質(zhì)，例如多糖、蛋白質(zhì)和次級代謝物等。氯仿和異丙醇等試劑分別用于去除多糖/次級代謝物和蛋白質(zhì)。此外，可以使用基于過濾柱或基于酶的方法去除污染的基因組DNA。

4、沉淀：純化和清洗抽提得到的RNA，進一步去除雜質(zhì)，以便后續(xù)使用。70%的乙醇、0.1%（v/v）焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的水或無DNase和無RNase的水都可以用來保存提取的RNA。最后，一旦RNA溶解在其中一種試劑中，必須在-80°C條件保存。

在此，我們從眾多提取方案中選擇了六種非常重要的試劑/操作方法，希望可以重點關(guān)注。

裂解液：用于破壞細胞膜并促使RNA釋放。通常是Trizol、苯酚或CTAB緩沖液。

氯仿：用于去除多糖。建議使用氯仿進行兩次洗滌以獲得更好的結(jié)果。

異丙醇：去除蛋白質(zhì)

乙醇：沉淀。通常RNA在70%乙醇中沉淀。

不含RNase和DNase的水：用于RNA提取的所有步驟，也可以用DEPC處理的水代替。DEPC處理水是通過將一定體積的蒸餾滅菌水與DEPC試劑（0.1%v/v）混合來制備的。

RNase：像RNaseA這樣的RNA酶是一種嘧啶特異性酶，可在胞嘧啶和尿嘧啶殘基處降解單鏈RNA。

通常，有關(guān)RNA的研究旨在分析mRNA，因為它編碼蛋白質(zhì)行使功能，是研究基因表達和調(diào)控的關(guān)鍵。但是，提取RNA時，會得到所有不同類型的RNA混合物。

可以通過計算μgRNA/mg組織來對RNA產(chǎn)物進行定量。然而，RNA定量是根據(jù)產(chǎn)物中占比最多的核糖體RNA進行評估的，因此，mRNA是間接地通過凝膠上的rRNA估值計算的。

如何通過估值“間接測量RNA”？

植物中的核糖體由兩個亞基組成，較大的亞基稱為28SrRNA，較小的亞基稱為18SrRNA。當(dāng)這兩個亞基都存在于凝膠上時，表明RNA質(zhì)量很高。如果RNA降解，其中一條條帶可能看起來模糊不清，或者兩條條帶都不會出現(xiàn)。

NanoDrop分光光度計是一種用于驗證獲得RNA的濃度和純度（或質(zhì)量）的儀器。為了評估提取的RNA的濃度和純度，研究人員會計算230nm、260nm和280nm處的吸光度比率。

如果RNA是純的，則260/280比率預(yù)計約為2。如果該比率明顯較低，則表明存在苯酚、蛋白質(zhì)或其他在280nm或附近強烈吸收的污染物。一般情況，260/230的比率，預(yù)計在2-2.2之間。如果該值相當(dāng)?shù)?，則表明存在雜質(zhì)（如：碳水化合物、EDTA、異硫氰酸胍和苯酚等）。低于預(yù)期的比率可能需要額外的清洗。

（1）把所有東西都放在冰上

為了抑制RNase活性，我們要確保RNA提取過程的每一步以及該過程中使用的所有工具都保持低溫。

（2）使用過濾移液器吸頭

使用非過濾移液器吸頭時，移液器筒的內(nèi)部可能是污染源，而過濾器吸頭可阻止顆粒物污染。

（3）戴手套

赤手是RNases的主要來源。在RNA提取時要始終戴手套并經(jīng)常更換。

（4）始終使用不含RNase/DNase的水。

可以購買不含RNase/DNase的水，也可以使用DEPC制備的溶液，該溶液的作用是使RNase酶失活，避免RNA降解。

（5）其他清洗步驟

有時根據(jù)不同的植物種類可能需要額外的清潔，例如，如果您的樣品含有大量多糖，則可以用氯仿清洗；若樣品含有大量蛋白質(zhì)污染物，則可以使用丙醇清洗。

（6）基因組污染

植物 RNA 提取的過程中，DNA 也會被釋放出來，因此基因組 DNA 的去除是影響 RNA 質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。

在使用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 質(zhì)量時，若存在 DNA 殘留，在 RNA 條帶上方、點樣孔下方會存在一條帶（如圖 1 所示）。DNA 殘留會對后續(xù)實驗會造成一定的影響。

解決方法：

（1）柱提法：減少樣本起始投入量，或使用脫氧核糖核酸酶 Ⅰ 進行膜上消化；

（2）細胞/組織總 RNA 提取法（Trizol 法）：向裂解液中加入氯仿后，需要在低溫下高速離心；向裂解液中加入氯仿后分層，吸取上清時避免吸到中間層和下層；

（3）若后續(xù)進行 RT-qPCR 實驗，逆轉(zhuǎn)錄時可選擇含有基因組清除模塊的產(chǎn)品。

（7）酚類化合物

很多植物組織特別是植物果實和樹木類植物中富含酚類物質(zhì)，它的含量會隨植物的生長而增加，且針葉類植物的酚類物質(zhì)含量要高于落葉類植物。

純凈的酚為無色，但易氧化為紅色至褐色的氧化產(chǎn)物。在提取植物 RNA 進行勻漿時，會產(chǎn)生「褐化效應(yīng)」，酚類物質(zhì)會釋放出來，氧化后勻漿液變?yōu)楹稚?，并且隨著氧化程度的增加而加深。被氧化的酚類化合物可與 RNA 穩(wěn)定的結(jié)合，從而影響 RNA 的分離純化。

解決方法：

（1）選擇幼嫩的組織作為實驗的材料；

（2）在裂解樣品的同時加入合適的抗氧化劑。

（8）多糖物質(zhì)

多糖是一種高分子聚合物，常見的多糖包括淀粉、纖維素等。植物組織中通常富含多糖，如馬鈴薯塊莖、甘薯等。多糖的許多物理性質(zhì)和 RNA 相似，因此很難將其與 RNA 分開。同時在沉淀 RNA 時，多糖還會產(chǎn)生膠狀沉淀，影響后續(xù)的操作。另外，多糖還會抑制后續(xù)實驗的酶活性。

解決方法：

可通過鹽酸胍處理去除部分多糖；在高濃度 Na+ 或 K+ 條件下，可通過苯酚、氯仿除去部分多糖；此外還可以通過 LiCl 沉淀 RNA，將多糖留在上清。但即使通過這些步驟也還會有很大一部分多糖與 RNA 分離不開，還需要更多有效的解決辦法。

（9）蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)是影響 RNA 質(zhì)量的另一重要因素。細胞均含有大量的蛋白質(zhì)，同時 RNase 也屬于蛋白質(zhì)，因而去除 RNA 中的蛋白質(zhì)在很大程度上會影響 RNA 的提取效果。

解決方法：

（1）冷凍條件下研磨植物材料抑制 RNase 活性；

（2）裂解液中添加合適的蛋白變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等；

（3）添加適量蛋白酶 K 以消化蛋白質(zhì)，再進行進一步的純化。

（10）次生代謝產(chǎn)物

次生代謝產(chǎn)物在植物對生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)上有著重要作用，其是細胞生命活動或植物生長發(fā)育正常進行的非必需小分子化合物，它的產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發(fā)育時期的特異性。

常見的次生代謝產(chǎn)物包括苯丙素類、醌類、黃酮類、單寧類、類萜、生物堿等，這些次級代謝產(chǎn)物容易與 RNA 結(jié)合一起被抽提出，從而影響 RNA 的質(zhì)量。

解決方法：

次生代謝產(chǎn)物多種多樣，且很多成分尚未完全鑒定，因此還沒有非常完整的方法來去除這些代謝產(chǎn)物。目前可以使用選擇性沉淀法、氯化銫梯度離心法和 RNA 回收純化法等來分離純化植物組織 RNA。

除了關(guān)注上面干擾植物 RNA 提取的因素，RNA 提取實驗作為各種分子生物學(xué)研究實驗的基礎(chǔ)，在實驗操作中，大家往往還會關(guān)注的是以下兩點：

提取時長：提取大量植物樣本時，事半功倍肯定是最理想的效果；

樣本兼容性：樣本涉及到簡單植物、多糖多酚植物時，能做到兼容并包是不二選擇。

（11）柱純化試劑盒和Trizol的區(qū)別

目前常用的總RNA提取方法主要分為兩類，一類是基于核酸柱純化技術(shù)的試劑盒，一類是經(jīng)典的溶劑提取法，以Trizol?為代表。

柱純化法的單價較高，但是提取過程相對簡單，通常無需額外準(zhǔn)備有害的溶劑，無需低溫離心機，新手易操作，所得RNA的質(zhì)量非常高，但是樣品間的穩(wěn)定性稍差，尤其是價格低的試劑盒，比較容易出現(xiàn)吸附柱之間的效率差異甚至出現(xiàn)壞柱子，對非常珍貴的樣品來說有一定的風(fēng)險。

溶劑提取法試劑非常便宜，但是提取過程稍稍復(fù)雜一些，對移液的要求較高，需要低溫離心機，需要使用有害的氯仿等溶劑（Trizol試劑本身就是十分有害的），優(yōu)點是樣品間的一致性很高，并且一份植物材料可以同步提取基因組DNA和總蛋白，一箭三雕。

柱純化法和溶劑法最大的區(qū)別是對小RNA的提取效率不同。除非特別強調(diào)，一般的柱純化試劑盒對小RNA的提取效率遠遠低于長片段RNA，因此普通柱純化試劑盒通常只適合蛋白表達基因的分析（100 nt以上），不適合miRNA、snRNA、4.5S rRNA、5S rRNA等小RNA分析，但是沉淀法可以有效的提取小片段RNA，適用于所有長度RNA的分析。根據(jù)實驗室的經(jīng)費和儀器情況，固定選擇一種提取方法并堅持使用，兩種方法交替使用有可能對qRT-PCR的結(jié)果造成一定的波動。

（12） 采樣時的注意點

RNA極易受到RNA酶的降解，基因表達對各種環(huán)境因素的變化高度敏感?；谝陨线@兩點，采樣時必須要快速、低溫，樣品間盡量保持操作一致，特別是對于需要轉(zhuǎn)錄組測序的樣品，需要格外注意。

任何微小的環(huán)境因素變化，包括光照、溫度、機械震動、濕度等，都會導(dǎo)致某些基因的表達快速發(fā)生變化，有些基因表達響應(yīng)甚至快到幾分鐘、幾十秒以內(nèi)。如果樣品較多，確保有足夠多的人手能夠同時收樣，植物材料離體后迅速用大量液氮凍透，保存在-80℃冰箱，如果需要長期保存，最好添加RNA穩(wěn)定劑/保存劑。

（13）樣品研磨和分裝

充分的研磨是RNA產(chǎn)量和質(zhì)量的保證。確保整個研磨過程中植物材料從未過熱融化，所有研磨器材、器皿都用液氮時刻充分預(yù)冷，特別是分裝研磨好的粉末的時候，由于比表面積太大，極易潮解融化，大大增加了RNA降解的概率，一定要確保所有離心管和藥匙始終冷卻。

如果使用Trizol，可以按照試劑盒推薦的比例把試劑直接加到植物材料中研磨，這樣即使是室溫研磨RNA也不會發(fā)生明顯降解。

不管是使用柱純化試劑盒還是Trizol，想要確保RNA質(zhì)量高，最關(guān)鍵的一點是保證足夠的液料比（裂解液：植物材料質(zhì)量）。一般來說柱純化試劑盒每個純化柱能夠處理的最大樣品鮮重在100毫克，Trizol法一般也控制在每毫升提取液最多100毫克鮮重（10:1）。

如果過于貪心，想用一個純化柱推薦的裂解液體積處理200毫克材料，結(jié)果一定是令人失望的。即便擬南芥是非常容易提取RNA的材料，5:1的液料比也不會有好結(jié)果。如果植物材料富含多糖多酚，還要進一步提高液料比，20:1~40:1都是很常用的比例。

（14） 提取過程中的注意事項

對于柱純化，務(wù)必要確保每一步離心都要充分。有時因為溶液太過黏稠，離心不充分時溶液很難一下子全部通過過濾柱或者RNA吸附柱，因此要根據(jù)情況延長離心的時間以及加大離心力。最后一步乙醇洗滌之后，一定要再次離心一到兩分鐘并開蓋晾干幾分鐘徹底除去乙醇，以免影響下游反應(yīng)。

對于溶劑提取法，有兩個做法可以提高RNA的質(zhì)量。一是加氯仿之前，就要離心去除不溶的細胞碎片（有些品牌試劑的說明書沒有特別強調(diào)這一步，反而出于節(jié)約時間的考慮建議直接向裂解液中加氯仿萃取然后離心），然后將上清吸出后再加氯仿萃取分層。這樣做可以提高色素和蛋白的萃取效率，提高RNA純度。

二是異丙醇沉淀RNA在室溫下進行，總時間10分鐘。低溫下沉淀反而會使得某些雜質(zhì)與RNA共沉淀下來，室溫沉淀有利于提高純度。不用擔(dān)心RNA降解的問題，RNA在異丙醇中非常穩(wěn)定。

（15）如何應(yīng)對RNA酶污染

對待RNA酶污染的態(tài)度，大抵分為兩類，一類是草木皆兵型，即便所有的器材都用高濃度DEPC處理好幾遍、采樣過程全程液氮低溫、磨樣品時液氮冷卻到手凍傷、提取過程全程戴口罩戴手套一句話也不說，還是戰(zhàn)戰(zhàn)兢兢擔(dān)心RNA會降解，仿佛哪怕旁邊的人從他身邊走過都會帶來RNA酶污染。

另一類是滿不在乎型，覺得自己什么器材都不處理，不戴口罩不用RNase滅活噴霧，全過程室溫，自己每次提出來的RNA用Nanodrop測參數(shù)也都很好。這兩種極端都不可取。嚴(yán)重的RNA酶污染并不是每次都會出現(xiàn)，甚至可以說非常罕見，可能幾個月幾年都遇不到一次，但是輕度的RNA酶污染其實很常見，只不過如果只用Nanodrop檢測在吸光度上沒有明顯的跡象，需要通過瓊脂糖電泳或者毛細管電泳才能發(fā)現(xiàn)（RIN值下降）。

所以，RNA提取實驗，對RNA酶最起碼的尊重還是要有的，器材一定要用無酶/除酶的，操作環(huán)境保持最基本的潔凈，DEPC處理一遍就可以了。但是也不至于提RNA時自己一句話也不說，還不準(zhǔn)別人從周圍走過。如果真的發(fā)生嚴(yán)重的系統(tǒng)性污染，RNA一直嚴(yán)重降解，通常要考慮提取試劑、DEPC水是不是被污染，以及移液器是否發(fā)生過嚴(yán)重倒吸導(dǎo)致整個內(nèi)部都被細菌污染。

（16）植物總RNA的特別之處

建議新手或者最近實驗環(huán)境發(fā)生較大變化的時候一定要通過電泳檢測RNA的完整性，而不是只依賴于分光光度計。教科書上一般都寫完整的RNA電泳時主要有三條帶，分別是28S、18S和5.8S三個核糖體RNA，28S rRNA的亮度大約是18S rRNA的兩倍。但是植物總RNA特別是光合組織的RNA與動物細胞總RNA相比有明顯的區(qū)別，通常至少有6條帶，且最大條帶的沉降系數(shù)與人RNA往往不一樣，通常為25S（以擬南芥為例）。

其中25S、18S和5.8SrRNA是來自于細胞質(zhì)基質(zhì)的80S核糖體，所有標(biāo)記為綠色的23Sab、16S、5S和4.5S rRNA都來自于葉綠體70S核糖體。16S與18S對應(yīng)，23S與25S對應(yīng)，特別的，正常情況下葉綠體中的23S rRNA轉(zhuǎn)錄出全長前體后會裂解成兩個分子，這也就是為什么在電泳圖中看不到25S和18S之間的23S RNA，只能看到兩條比16S更小的條帶。在某些突變體中可以看到未被剪切的23S rRNA前體。