多肽純化中的常見15個(gè)問題與解答，妥妥的干貨

1、檢測肽純度的一般方法是什么？

它通常由高效液相色譜法（HPLC）測定。

2、肽含量和肽純度有什么區(qū)別？

肽不僅包含正確的肽，還包含雜質(zhì)，例如生產(chǎn)中的水和有機(jī)鹽。肽純度是指相對(duì)于所有雜質(zhì)（水分除外）正確肽的數(shù)量。然而，肽含量是目標(biāo)肽相對(duì)于樣品中其他所有物質(zhì)的百分比，通常由 N 元素分析和氨基酸分析確定。因此，即使肽純度達(dá)到99%，考慮到水和有機(jī)鹽，含量仍可能為70%-80%。

3、肽分離純化最常用的技術(shù)是什么？

最常見的技術(shù)是反相高效液相色譜 (RP-HPLC)。

4、RP-HPLC 中通常使用哪種流動(dòng)相進(jìn)行肽分離和純化？

最常見的流動(dòng)相是水和乙腈，三氟乙酸充當(dāng)離子對(duì)試劑。根據(jù)不同的肽段，采用合適的梯度洗脫進(jìn)行分離。

5、為什么在流動(dòng)相中添加 TFA 作為離子對(duì)試劑？是否有任何其他流動(dòng)相或離子對(duì)試劑可用于肽分離和純化？

TFA可用于調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，作為離子對(duì)試劑與多肽相互作用，增強(qiáng)分離效果，顯著改善峰形。

其他用于多肽分離純化的流動(dòng)相或離子對(duì)試劑包括乙酸體系、磷酸體系、鹽酸體系、七氟丁酸等，可通過調(diào)節(jié)pH達(dá)到很好的分離效果。

6、如何溶解多肽？

大多數(shù)肽可以溶解在超純水中。對(duì)于一些不溶性肽，需要先分析氨基酸序列。酸性肽可先溶于少量堿性溶液（如0.1%氨水），然后稀釋至所需濃度。作為堿性肽，可溶于少量酸性溶液（如乙酸、三氟乙酸），然后稀釋至所需濃度。對(duì)于疏水肽，可溶于強(qiáng)極性有機(jī)溶劑，如DMF、甲醇、丙醇、異丙醇、DMSO等。

7、RP-HPLC中常用的色譜填料有哪些？

最常見的填料是 C18、C8 和 C4 反相色譜柱。

8、純化中如何選擇色譜填料？

不同序列的肽在理化特性和疏水性方面表現(xiàn)出很大差異。在大多數(shù)情況下，C18 色譜柱對(duì)分子量小于 4000 或親水性的肽段的分離效果最好。C4 柱適用于分子量超過 5000 或疏水末端。C8列介于C18和C4之間，其效果更類似于C18。對(duì)于一些特殊的選擇性肽段，也可以選擇苯基柱和聚合物柱。

9、純化中選擇聚合物填料的原則是什么？

當(dāng)需要更高的 pH 或溫度時(shí)，具有寬 pH 范圍的聚合物 HPLC 柱可能適用于純化。它們在極端pH條件下不會(huì)降解，因此可以使用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿作為流動(dòng)相進(jìn)行分離和純化。

10、什么會(huì)影響多肽純化的結(jié)果？

影響因素很多，主要包括流動(dòng)相、色譜柱類型、柱溫、波長、色譜儀性能等。這些差異可能會(huì)導(dǎo)致最終結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤。

11、頻繁的基線漂移可能是什么原因？如何解決？

反相分離中基線漂移的主要原因是固定 TFA 濃度的梯度洗脫會(huì)導(dǎo)致 210-220 nm 處的吸收基線發(fā)生偏移。建議使檢測波長盡可能接近215 nm，以減少或消除TFA吸收光譜變化對(duì)基線漂移的影響。此外，與溶劑 B 相比，溶劑 A 中添加的 TFA 減少 15% 可以補(bǔ)償基線漂移。例如，如果溶劑 A 中的 TFA 濃度為 0.1%，則建議溶劑 B 中添加 0.085%

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12、反相色譜純化后，如何從最終產(chǎn)品中去除流動(dòng)相中的TFA、乙腈等雜質(zhì)？

只要不超過耐受范圍，凍干可能是去除大部分 TFA 和乙腈的最簡單和最有效的方法。但該方法不能滿足一些對(duì)TFA含量要求較高的多肽類藥物的要求。應(yīng)與它們進(jìn)行特殊的鹽轉(zhuǎn)化和脫鹽。

13、肽的一般鹽形式有哪些？如何轉(zhuǎn)換鹽形式或脫鹽？

大多數(shù)肽在TFA系統(tǒng)下純化，因此TFA鹽是最常見的形式，其次是乙酸鹽和鹽酸鹽形式，很少有肽藥物是特殊鹽形式。離子交換和 HPLC 是最常用的鹽轉(zhuǎn)化方法，而 G25（GE Healthcare 的葡聚糖凝膠）柱可用于脫鹽。

14、TFA 是否僅用于調(diào)節(jié)緩沖液中的 pH 值？TFA 濃度越高，基線漂移越嚴(yán)重。這是否意味著如果緩沖液的 pH 值允許，TFA 的濃度越低越好？

TFA可以作為離子對(duì)，濃度通常在0.05-0.1%左右。濃度過高會(huì)使溶液過酸，影響色譜柱的使用時(shí)間。

同時(shí)，TFA 可以抑制硅膠表面的硅烷醇基團(tuán)，改善堿性化合物的峰形。如果使用 0.1% TFA 有時(shí)分離效果不好，可以嘗試 0.2% TFA，但使用后需要立即沖洗色譜柱。

在梯度洗脫時(shí)，由于基線漂移，它對(duì)制備的影響很小。

15、為什么肽樣品需要在上樣柱前進(jìn)行預(yù)處理？有哪些制備方法？

制備柱更容易被污染，因?yàn)榕c分析柱相比，它們處理的樣品更多。因此，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理以延長色譜柱的使用時(shí)間。主要有五種方法：過濾、離心、柱前過濾和在線過濾。